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遗传神经网络和遗传算法优选黄芪皂苷类成分的微波提取工艺条件

2019-12-16

摘要:目的基于中心组合试验设计(central-composite design,CCD),采用遗传神经网络(genetic neural network,GNN)和遗传算法(geneticalgorithm,GA)优选黄芪皂苷类成分的微波提取工艺条件。方法构建黄芪皂苷的HPLC指纹图谱,选择含量较高的7种成分(黄芪皂苷I~V和异黄芪皂苷I、II),以峰面积代替质量浓度,将通过熵权法计算得到的综合得分作为评价指标。在单因素实验基础上,运用CCD开展实验,构建遗传神经网络以建立提取工艺条件与评价指标之间的定量关系,并通过遗传算法优选微波提取黄芪皂苷成分的最佳工艺参数,并与响应面法优化结果进行比较。结果通过GNN与GA获得的最佳提取工艺条件为提取时间260 s、提取功率695 W、乙醇体积分数50%、液料比21.5,7个皂苷成分的综合得分为1 432.584;响应面分析法获得最佳提取工艺条件为提取时间190 s、提取功率880 W、乙醇体积分数70%、料液比18.5,7个皂苷成分的综合得分为1 066.236;GNN与GA所获提取工艺条件可有效增加综合得分。结论通过熵权法以及遗传神经网络构建黄芪皂苷成分与微波提取工艺条件之间的数学模型是可行的,可为实现中药有效部位多成分提取、分离纯化的工艺优选提供一种新的模式。


中药黄芪又名绵芪,为豆科植物膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.或蒙古黄芪A.membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根及根茎[1]。黄芪在医药、食品、保健品等领域具有十分广泛的应用,其化学成分主要包括多糖、黄酮及三萜皂苷等[2-4]。现代药理学研究表明,黄芪皂苷类成分具有改善心血管、抗肿瘤等作用,是黄芪发挥药效的有效成分,具有良好的开发利用前景[5-10]。


微波提取技术相比较于常规的加热回流、超声提取等技术,具有快速、溶剂用量少、提取率高等优点,广泛应用于中药有效成分的提取[11]。中药提取工艺优选指的是单味中药采用不同的提取因素和水平,或者多味中药依据不同配方比例采用不同的提取因素和水平,按照已有的实验设计方法和提取技术进行中药化学成分的提取,并依据目标产物的得率,最终得到最佳工艺条件和最佳处方配比。因此,研究者们往往合理选择一部分实验,以较少的实验数据,通过数据分析,推断出整体的最佳试验方案。其中,Box-Behnken试验设计(BBD)、中心组合试验设计(central-compositedesign,CCD)、均匀试验设计等是较为常用的试验设计方法[12-14]。由于提取条件之间及其与目标产物之间的关系错综复杂,有些甚至是随机的、模糊的,因此必须求助于能够解决非线性的、复杂系统问题的高新技术。通过采用具有网络结构的机器学习模型和具有自适应能力的全局优化算法,可分析两者的内在关系和规律,最终形成一个复杂的非线性系统函数来揭示数据之间的关系。已有文献报道以黄芪甲苷或总皂苷的含量作为指标,优选黄芪皂苷成分的微波提取工艺条件[15]。但以单一成分为指标无法体现中药有效部位的复杂性、多成分及其之间相互作用的特点,而通过可见分光光度法进行总皂苷含量测定,容易因为显色方法的特异性较差导致实验结果的偏差。本实验以黄芪皂苷HPLC指纹图谱中含量较高的7个成分含量作为检测指标,通过熵权法赋予7个成分相应的权重。根据计算出的综合得分,在单因素的基础上采用中心组合试验设计开展实验,通过遗传算法(genetic algorithm,GA)对遗传神经网络(geneticneural network,GNN)进行改进,基于优化后的遗传算法-遗传神经网络模型优选黄芪皂苷类成分的微波提取工艺条件,为其今后进一步开展药理学研究提供物质基础。


1仪器与材料


RW1.5S-5E型微波动态萃取设备,南京澳润微波科技有限公司;Agilent1260Infinity型高效液相色谱仪,美国安捷伦科技有限公司;ABSCIEX 4500 QTRAP质谱仪,美国AB SCIEX公司;Mettler Toledo XP105电子天平,瑞士梅特勒-托利多仪器公司;Synergy?UV System Milipore纯水制备仪,美国Millipore公司。


黄芪,购于浙江中医药大学名中医馆,经浙江中医药大学黄绳武教授鉴定为豆科植物膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根(批号190111~190120,分别编号为S1~S10),药材粉碎后过20目筛,得黄芪药材粉末;乙腈为色谱纯,美国Tedia公司;乙醇试剂为分析纯,杭州汇普化工仪器有限公司;正丁醇,成都市科隆化学品有限公司;纯化水由Millipore纯水制备仪制备;黄芪甲苷对照品,批号SZ20180506HQJG,质量分数≥98%,南京世洲生物科技有限公司。


2方法与结果


2.1 HPLC指纹图谱的建立


2.1.1黄芪提取液的制备参照《中国药典》2015年版方法进行。精密称定黄芪药材粉末4 g,用滤纸包裹后置索氏提取器中,加甲醇40 mL,冷浸过夜,再加甲醇适量,加热回流4 h。提取液溶剂回收并浓缩至干,残渣加水10 mL,微热使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次40 mL,合并正丁醇液,蒸干正丁醇后加甲醇复溶并定容至10 mL,即得[1]。


2.1.2对照品溶液的制备取黄芪甲苷对照品适量,置于10 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容,制成含黄芪甲苷0.92 mg/mL的对照品溶液。


2.1.3色谱条件色谱柱为AgilentZorbax SB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相为乙腈-水,线性梯度洗脱:0~5 min,35%~38%乙腈;5~8 min,38%~50%乙腈;8~10 min,50%~60%乙腈;10~15 min,60%~70%乙腈;15~23 min,70%~80%乙腈;23~29 min,80%~95%乙腈;29~32 min,95%乙腈;检测波长203 nm;体积流量1 mL/min;柱温30℃;进样量20μL。以黄芪甲苷对照品计算理论塔板数不低于64 000。


2.1.4质谱条件电离源:电喷雾离子源(ESI);检测方式:在正离子模式下对样品进行二级质谱数据采集。ESI源参数如下:扫描速度10 000 amu/s;扫描质量数范围m/z 300~2 000;气帘气206.85 kPa(30 psi);喷雾电压4 500 V;离子源温度500℃;雾化器344.75 kPa(50 psi);加热气344.75 kPa(50 psi);碰撞气为高纯氮气;样品数据处理使用Analyst V1.6.2软件。

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2.1.5药材指纹图谱的建立分别精密吸取10批黄芪提取液,0.22μm微孔滤膜滤过,按“2.1.3”项下色谱条件记录色谱图,将所得到的10批样品图谱代入到“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)”中,设定第S1批样品图谱为参照图谱,自动匹配色谱峰,生成黄芪提取液的对照指纹图谱(图1)。HPLC-ESI-MS获取质谱信息,通过与文献中报道黄芪皂苷类化合物的相对分子质量比对、质谱规律[16-17]及结合部分对照品分析,推测出7个皂苷成分色谱峰的化合物归属,具体保留时间和质谱信息见表1,其中相对分子质量相近的成分依据其在色谱图上的出峰顺序不同进行判断。

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2.1.6精密度试验取同一批药材提取液,连续进样6次,以黄芪甲苷的保留时间和峰面积为参照,计算图谱中7个成分峰的相对保留时间RSD均小于2.0%,相对峰面积RSD均小于3.0%,说明仪器精密度良好。


2.1.7稳定性试验取同一批药材提取液,分别在0、2、4、6、10、12 h进样,以黄芪甲苷的保留时间和峰面积为参照,计算图谱中7个成分峰的相对保留时间RSD均小于2.0%,相对峰面积RSD均小于3.0%,说明样品在12 h内稳定性良好。


2.1.8重复性试验取同一批次药材粉末6份,平行操作制备黄芪提取液,以黄芪甲苷的保留时间和峰面积为参照,计算图谱中7个成分峰的相对保留时间RSD均小于2.0%,相对峰面积RSD均小于3.0%,证明方法重复性良好。


2.2单因素实验


2.2.1指标确定由于黄芪中皂苷类成分的HPLC色谱峰峰面积与其质量浓度呈正比,故本实验以峰面积代替质量浓度,以其为指标优化提取工艺。


2.2.2指标权重及综合得分计算运用熵权法对7种黄芪皂苷类成分赋予相应的权重系数(wj),其中j=1,2,…,7。熵权法计算公式步骤如下:


(1)指标的归一化处理:xij′为第i个提取样品的第j个指标成分的峰面积值(i=1,2,…,n;j=1,2,…,m)。为了方便起见,归一化后的数据仍记为xij。

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通过Matlab软件编写上述熵权法计算过程对应的程序,为7种皂苷成分的峰面积赋予相应的权重wj,由此得到样品的综合得分(Qi)。


Sij为第i个提取样品的第j个指标成分,即峰面积


2.2.3提取次数的考察称取黄芪粗粉约20 g,置于微波提取设备中,用10倍量95%乙醇分别提取1、2、3次,每次120 s,功率为800 W,提取转速为90 r/min,每间隔30 min再次提取,提取液滤过后合并,浓缩近干后加水10 mL复溶,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次40 mL,合并正丁醇液,蒸干正丁醇后加甲醇复溶并定容至10 mL,测定各皂苷成分的峰面积,由“2.2.2”项下Qi值公式计算综合得分Qi,结果见表2。当提取次数为2时,Qi值最大,故选择提取次数2次(黄芪皂苷成分峰面积分别用以下符号表示:S1-黄芪皂苷I、S2-黄芪皂苷II、S3-黄芪皂苷III、S4-黄芪皂苷IV、S5-黄芪皂苷V、S6-异黄芪皂苷I、S7-异黄芪皂苷II)。

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2.2.4提取转速的考察称取黄芪粗粉约20 g,加入10倍量的95%乙醇提取2次,每次提取时间为120 s,提取功率为800 W,提取转速设为90、180、270、360、450 r/min,每隔30 min再次提取,提取液滤过后合并,按“2.2.3”项下方法处理,测定各皂苷成分的峰面积,由“2.2.2”项下Qi值公式计算综合得分Qi,结果见表3。当提取转速为270 r/min时,Qi值最大,故选择提取转速270 r/min。

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2.2.5液料比的考察称取黄芪粗粉约20 g,分别加入12、14、16、18、20、22、24、26、28、30倍量95%乙醇提取2次,每次120 s,功率为800 W,提取转速为90 r/min,每间隔30 min再次提取,提取液滤过后合并后按“2.2.3”项下处理,测定各皂苷成分的峰面积,由“2.2.2”项下Qi值公式计算综合得分Qi,结果见表4。当液料比为18、20时二者Qi值相近,但当液料比超过20时Qi值迅速下降,因此选择液料比为18。

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2.2.6提取时间的考察称取黄芪粗粉约20 g,加入10倍量95%乙醇提取2次,提取时间分别为60、120、180、240、300 s,功率为800 W,提取转速为90 r/min,每间隔30 min再次提取,提取液滤过后合并后按“2.2.3”项下处理,测定各皂苷成分的峰面积,由“2.2.2”项下Qi值公式计算综合得分Qi,结果见表5。当提取时间为180 s时,Qi值最大,故选择提取时间为180 s。

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2.2.7提取功率的考察称取黄芪粗粉约20 g,加入10倍量95%乙醇提取2次,每次120 s,功率分别为600、800、1 000、1 200、1 400 W,提取转速为90 r/min,每间隔30 min再次提取,提取液滤过后合并,按“2.2.3”项下方法处理,测定各皂苷成分的峰面积,由“2.2.2”项下Qi值公式计算综合得分Qi,结果见表6。功率过高时溶剂蒸发太快,可能会影响料液比和乙醇体积分数,因此后续实验选择提取功率800 W。

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2.2.8乙醇体积分数的考察称取黄芪粗粉约20 g,加入10倍量的95%、85%、75%、65%、55%、45%的乙醇提取2次,每次120 s,功率为800 W,提取转速为90 r/min,每间隔30 min再次提取,提取液滤过后合并,按“2.2.3”项下方法处理,测定各皂苷成分的峰面积,由“2.2.2”项下Qi值公式计算综合得分Qi,结果见表7。当乙醇体积分数为65%时Qi值最大,故选择乙醇体积分数为65%。

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2.3 CCD试验设计及结果


根据单因素实验结果,选取提取时间(A)、微波功率(B)、乙醇体积分数(C)、液料比(D)4个因素作为自变量。根据“2.2.2”项计算赋予黄芪各成分峰面积值相应的权重,黄芪皂苷I为0.114,黄芪皂苷II为0.064,黄芪皂苷III为0.213,黄芪皂苷IV为0.255,黄芪皂苷V为0.200,异黄芪皂苷I为0.132,异黄芪皂苷II为0.022,代入“2.2.2”项下Qi值公式计算Qi值。以黄芪7个皂苷成分综合得分(Qi值)为因变量,根据CCD原理,并在模型选择中设置参数上下限水平(α)为1.718 85(即正交二次型,orthogonal quadratic),中心点选择为6,实验结果见表8。

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采用响应面分析法,运用Design-Expert 8.0软件对各因素水平进行建模与优化,结果见表9。各因素经回归拟合所得的方程为Qi=?7 185.398+10.179 A+122.256 C-0.017 A2-0.701 C2(剔除P>0.05项后),并且得到最佳的提取工艺为提取时间192.12 s,提取功率879.93 W,乙醇体积分数70%,料液比18.62,最大预测Qi值为1 134.25。考虑到操作的可行性,将提取工艺修正为提取时间190 s,提取功率880 W,乙醇体积分数70%,液料比18.5。

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由表9可知,非线性方程模型P<0.05,表明该模型显著,其校正决定系数r2为0.973 6,表明97.36%的试验数据的变异性可用此回归模型来解释,可靠度较高。但是该模型失拟项P<0.000 1,表明该模型可能无法有效预测最终的Qi值。因此,响应面分析法不能很好建立提取工艺条件与目标产物之间的关系。


2.4遗传神经网络与遗传算法优选


2.4.1遗传神经网络建模将响应面中的30组数据作为神经网络中的样本,以4个提取工艺条件为输入变量,以黄芪7种皂苷成分经赋权后计算得到的综合得分Qi值的作为输出变量。采用10折交叉验证方法将数据分为2组:90%的样本作为训练数据,10%的样本作为验证数据,并将神经网络模型的最大迭代次数设定为2 000。

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不同神经元数目下训练数据和验证数据的最大决定误差(MAEtrain和MAEtest)、数据的整体误差(MAE)以及决定系数(R2)见表10。由表10可知,当神经元数目越高,R2值越高。但过多的神经元会增加神经网络模型学习时间,并会使训练掉入局部极小点的陷阱,从而导致“过拟合”的情况出现。因此,本实验选择神经网络的隐藏层神经元数目为4进行进一步的预测。最终确定为4个输入层,1个隐藏层,4个隐藏层节点的遗传神经网络模型。


2.4.2遗传算法进行优选选用训练好的遗传神经网络模型,采用遗传算法搜寻中药提取工艺的最佳参数组合。采用实数编码方式,种群大小为1 000,最大迭代次数为200,其他参数均设为默认值,得到的最佳提取工艺参数为提取时间264.03 s、提取功率695.44 W、乙醇体积分数51.13%、液料比21.46,综合得分为1 432.584。同时,对响应面分析法、遗传神经网络与遗传算法优选法得到结果进行试验验证,结果见表11。

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3讨论


大量研究表明,皂苷类成分是黄芪中重要的生理活性物质,在调节心脑血管系统功能、保护大脑损伤、改善血液流变学等方面具有十分广泛的药理作用[18]。因此,将皂苷类成分作为测定目标,可以为黄芪中有效部位的质量评价和质量控制提供参考。皂苷类成分往往通过HPLC结合紫外检测或蒸发光散射检测(ELSD)来对其进行含量测定[19-20]。虽然ELSD在测定没有紫外吸收或紫外吸收较弱的物质时能够取得较理想的结果,但是其作为一种通用型质量检测器,在含量测定过程中往往能够检测出所有的物质,缺少一定的专属性,对于低浓度样品灵敏度偏低,对于结果的重现性无法取得满意的效果[21]。并且ELSD的响应值与被测物浓度的关系曲线较为复杂,在较高浓度时呈线性,而在较低浓度范围时呈指数关系。而紫外检测器相比较于ELSD具有更高的灵敏度和检测限,相关文献也表明,通过HPLC结合紫外检测器进行皂苷类成分的含量测定时能够取得良好的精密度和稳定性、重现性[22-24]。此外,通过HPLC结合紫外检测器与质谱仪器相串联,可以快速、有效地推测已知化合物及隐性成分的归属[25]。


由于中药中的有效部位往往不仅仅含有一种成分,因此要对其进行多目标优选。而在多目标优选过程中,各个成分占总成分中的百分比(即权重)的分配往往十分关键。部分学者采用主观赋权法,但是这种方法容易有一定的主观随意性,无法体现评价指标之间的内在联系,从而影响到了权重分配的合理性。而当采用客观赋权法时,能够避免这种情况的出现,从而使得赋予的权重更加的合理、可靠[26]。目前,响应面分析法作为一种常用的多变量问题分析统计方法,可通过考察各个工艺条件对目标产物指标影响的显著程度,挑选出关键性工艺条件。但是响应面法的方程拟合限制在二次多项式的基础上,拟合相关系数较低,往往容易使预测结果与实际结果有较大的误差。


随着人工智能的迅猛发展,研究者们不断寻找新的中药提取工艺模型及其优选算法[27]。作为一种网络结构的数学模型,神经网络具有优良的逼近能力,在众多领域中都有着广泛应用,近年来在中药提取、纯化工艺优化等方面也有所应用[28]。遗传神经网络可通过分析预先提供的一批相互对应的输入、输出数据,建立一个复杂的非线性模型来揭示数据之间的定量关系[29],可用于函数拟合与模式识别。但是,传统遗传神经网络存在着学习速度慢、容易陷入局部极小值等缺点,因此往往需要对其进行适当改进。考虑到遗传算法是模拟生物进化过程的优化算法,可对神经网络权值采取“适者生存,优胜劣汰”的进化规律进行选择,使其成为一种全局优选的算法,应用于提取工艺条件优选[30]。通过遗传算法优化后的神经网络进行工艺寻优,可以得到更准确可信的结果。应当注意的是,在对遗传算法进行编码前,需给每个基因设定约束条件,即各工艺参数都有着各自取值的上下限,超出此范围就会造成寻优不符实际条件。


本实验通过结合HPLC指纹图谱和熵权法对黄芪中含量较高的几种皂苷成分进行确定并赋予权重,从而对其提取工艺进行优化,与以单一成分或将总皂苷成分含量作为指标相比,能够体现中药成分的多样性及其相互影响作用。通过编写熵权法程序对HPLC图谱中的黄芪各皂苷成分进行赋权,综合评价黄芪中7个皂苷成分,将多目标转化为单目标,通过CCD试验设计得到30组试验条件及其相应的综合得分,将这些数据作为遗传神经网络的训练样本进行拟合,再通过响应面法及遗传算法分别对其进行预测,从而得到多目标优选工艺条件参数,能够为中药有效成分多目标工艺寻优提供参考。通过遗传算法优化的遗传神经网络模型预测后得到的最佳微波提取工艺为提取时间260 s,提取功率695 W,乙醇体积分数50%,料液比21.5。本实验通过遗传算法优化后的遗传神经网络模型相关系数达到98.98%,预测结果与实验结果相接近,表明通过该模型优选出的工艺具有可信度,联用熵权法、响应面分析法、遗传神经网络模型筛选黄芪皂苷类成分微波提取工艺是合理、可行的。


参考文献(略)


来源:黄鹏程,金伟锋,万海同,李畅,陈建真,楼小红,何昱.遗传神经网络与遗传算法优选黄芪皂苷微波提取工艺条件[J].中草药,2019,50(16):3815-3823.


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